Pembuatan Tahu dan Pengujian Kadar Protein

Kedelai

Kedelai adalah salah satu tanaman polong-polongan yang menjadi bahan dasar banyak makanan dari Asia Timur seperti kecap, tahu, dan tempe. Berdasarkan peninggalan arkeologi, tanaman ini telah dibudidayakan sejak 3500 tahun yang lalu di Asia Timur. Kedelai putih diperkenalkan ke Nusantara oleh pendatang dari Cina sejak maraknya perdagangan dengan Tiongkok, sementara kedelai hitam sudah dikenal lama orang penduduk setempat. Kedelai merupakan sumber utama protein nabati dan minyak nabati dunia. Penghasil kedelai utama dunia adalah Amerika Serikat meskipun kedelai praktis baru dibudidayakan masyarakat di luar Asia setelah 1910.

Kedelai dikenal dengan berbagai nama: sojaboom, soja, soja bohne, soybean, kedele, kacang ramang, kacang bulu, kacang gimbol, retak mejong, kaceng bulu, kacang jepun, dekenana, demekun, dele, kadele, kadang jepun, lebui bawak, lawui, sarupapa tiak, dole, kadule, puwe mon, kacang kuning (Aceh) dan gadelei. Berbagai nama ini menunjukkan bahwa kedelai telah lama dikenal di Indonesia. Secara ilmu taksonomi tumbuhan, sistematika tanaman kedelai adalah sebagai berikut:

Kerajaan : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Fabales

Famili : Fabaceae

Upafamili : Faboideae

Genus : Glycine, sp

Kedelai merupakan tanaman dikotil semusim dengan karakteristik sedikit bercabang, sistem perakara tunggang, dan batang berkambium. Kedelai dapat berubah menjadi tumbuhan setengah merambat dalam keadaan pencahayaan rendah. Kedelai, khususnya kedelai putih dari daerah subtropik, juga merupakan tanaman hari-pendek dengan waktu kritis rata-rata 13 jam. Ia akan segera berbunga apabila pada masa siap berbunga panjang hari kurang dari 13 jam. Ini menjelaskan rendahnya produksi di daerah tropika, karena tanaman terlalu dini berbunga.
Di Indonesia, kedelai menjadi sumber gizi protein nabati utama. Karena akarnya memiliki bintil pengikat nitrogen bebas, kedelai merupakan tanaman dengan kadar protein tinggi sehingga tanamannya digunakan sebagai pupuk hijau dan pakan ternak. Pemanfaatan utama kedelai adalah dari biji. Biji kedelai kaya protein dan lemak serta beberapa bahan gizi penting lain, misalnya vitamin (asam fitat) dan lesitin. Olahan biji dapat dibuat menjadi
· Tahu (tofu),
· Bermacam-macam saus penyedap (salah satunya kecap, yang aslinya dibuat dari kedelai hitam),
· Tempe
· Susu kedelai (baik bagi orang yang sensitif laktosa),
· Tepung kedelai,
· Minyak (dari sini dapat dibuat sabun, plastik, kosmetik, resin, tinta, krayon, pelarut, dan biodiesel.
· Taosi
· Tauco

Kandungan Nutrisi Pada Kedelai

Kandungan nutrisi pada 100 gram kacang kedelai mentah secara literatur, yaitu sebagi berikut:
Air : 67.5 g Energi : 147 kca Energi : 615 kJ Protein : 12.95 g Total Lemak : 6.8 g Karbohidrat : 11.05 g Serat : 4.2 g Ampas : 1.7 g

Pembuatan Tahu

Secara kimia dapat dikatakan bahwa proses pembuatan tahu adalah pengendapan protein yang terdapat dalam sari kedelai pada titik isoelektrisnya. Protein yang terdapat dalam kacang kedelai adalah legumeilin dan glisinin. Legumeilin termasuk dalam kelas albumin dan glicinin termasuk dalam kelas globulin. Kedua macam protein ini mempunyai sifat yang berbeda kelarutannya dalam air, dimana albumin larut dalam air dan globulin tidak larut dalam air. Oleh karena itu, pada proses pembuatan tahu, yang diendapkan adalah legumeilin nya karena pada umumnya proses pembuatan tahu menggunakan pelarut air.
Untuk mendapatkan protein yang terdapat dalam kedelai, maka terlebih dahulu kedelai tersebut diolah menjadi sari kedelai yang merupakan ekstrak protein dari kedelai. Pembuatan sari kedelai diawali dari pemilihan biji kedelai. Biji kedelai yang digunakan, yaitu kedelai yang mempunyai kualitas yang baik, ini dapat dilihat dari ukuran kacangnya yaitu besar-besar dan warnanya kuning gading. Selanjutnya perendaman kacang kedelai dilakukan selama 8 hingga 12 jam yang bertujuan untuk melunakkan dinding kedelai sehingga pada saat dibersihkan, kulit kedelai akan mudah terlepas. Tahap selanjutnya, yaitu menghilangkan kulit kedelai.
Sesudah kedelai bersih, maka kedelai digiling dengan menggunakan alat penggiling sehingga butiran kedelai yang besar menjadi kecil-kecil dan memeliki luas permukaan yang besar, akibatnya jika ada pelarut maka zat terlarut akan lebih mudah diperoleh. Langkah ini memang sengaja dilakukan agar komponen yang ada dalam kedelai, berupa legumeilin yang memiliki sifat dapat larut dalam air akan terekstraksi atau terlarut.

Pengaruh Pengolahan Kedelai Terhadap Kadar Protein

Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga.
Protein merupakan suatu polipeptida dengan berat molekul (BM) yang sangat bervariasi, yaitu berkisar antara 5000 sampai lebih dari satu juta. Karena ukuran molekul protein besar, maka protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif.
Struktur protein dapat dibagi menjadi empat bentuk, yaitu primer, sekunder, tersier dan kuartener. Susunan linier asam amino dalam protein merupakan struktur primer. Susunan tersebut akan menentukan sifat dasar protein serta sifat bentuk struktur sekunder dan tersiernya. Bila protein banyak mengandung asam amino dengan gugus hidrofobik, maka daya kelarutannya kurang dalam air dibandingkan dengan protein yang banyak mengandung asam amino dengan gugus hidrofil.
Protein yang terdapat dalam bahan pangan mudah mengalami perubahan-perubahan, antara lain:
1. Dapat terdenaturasi oleh perlakuan pemanasan.
2. Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh perlakuan pengasaman.
3. Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim-enzim proteolitik.
4. Dapat bereaksi dengan gula reduksi, sehingga menyebabkan terjadinya warna coklat.
Denaturasi protein dapat diartikan sebagai suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein tersebut tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Karena itu denaturasi dapat diartikan sebagai suatu proses terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein.

Denaturasi Protein Karena Panas

Panas dapat digunakan untuk merusak ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar yang terdapat pada protein. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemanasan/ pemasakan. Beberapa makanan dimasak untuk mendenaturasi protein yang dikandung supaya memudahkan enzim pencernaan untuk mencerna protein tersebut.
Pemanasan akan membuat protein bahan terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tetapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida. Proses ini biasanya berlangsung pada kisaran suhu yang sempit.
Secara umum semakin tinggi suhu pelarut, akan mengakibatkan interaksi antara molekul pelarut dan zat terlarut semakin tinggi. Akibatnya komponen yang terlarut akan semakin banyak. Keadaan ini akan menyebabkan sari kedelai yang dihasilkan akan semakin pekat pula. Semakin pekat sari kedelai yang dihasilkan, maka tahu yang dihasilkannya pun akan semakin banyak. Hal ini disebabkan karena tahu dibuat dengan jalan menambahkan zat pengental yang berupa batu tahu atau garam atau asam pada sari kedelai. Oleh karena itu, jika sari kedelai yang dihasilkan semakin banyak, maka ini berarti jumlah protein pada tahu yang dihasilkan akan semakin banyak. Pernyataan ini didukung oleh Sutrisno Kuswara dalam bukunya pengolahan kedele menjadi makanan bermutu mengatakan, bahwa penambahan air pada saat menggiling kedele sebaiknya pada suhu 80 – 100oC agar menghasilkan tahu dengan jumlah protein yang tinggi.
Proses pembuatan tahu yang baik adalah menghasilkan jumlah tahu yang banyak serta memiliki kualitas tahu yang baik. Salah satu indikator yang digunakan untuk menentukan kualitas atau mutu dari tahu adalah kadar proteinnya tinggi. Kadar protein dalam 100 gram adalah 7,9 gram. Kadar protein yang ada dalan suatu bahan sangat ditentukan dari proses pembuatannya, dimana salah satu sifat dari protein adalah tidak tahan terhadap panas. Adanya panas yang tinggi akan menyebabkan protein rusak sehingga kadarnya akan menurun.

Metode Analisis Protein

Analisis jumlah protein dilakukan dengan menentukan jumlah nitrogen yang dikandung oleh suatu bahan. N total bahan diukur dengan menggunakan metode mikro-kjedahl. Prinsip dari metode ini adalah oksidasi senyawa organik oleh asam sulfat untuk membentuk CO2 dan H2O serta pelepasan nitrogen dalam bentuk ammonia. Kadar ammonia ini akan sebanding dengan kadar N yang terdapat pada kedelai dan hasil pengolahannya. Dalam penentuan protein, seharusnya hanya nitrogen yang berasal dari protein saja yang ditentukan. Akan tetapi teknik ini sulit sekali dilakukan mengingat kandungan senyawaan N lain selain protein dalam bahan juga terikut dalam analisis ini. Jumlah senyawaan N ini biasanya sangat kecil yang meliputi urea, asam nukleat, ammonia, nitrat, nitrit, asam amino, amida, purin, dan pirimidin. Oleh karena itu penentuan jumlah N total ini tetap dilakukan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Kadar protein yang ditentukan dengan cara ini biasa disebut sebagai protein kadar/crude protein. Analisis protein cara kjedahl pada dasarnya dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, destilasi dan titrasi.

Proses Pembuatan Tahu dari Kedelai

1. Memilih kedelai bersih dan kemudian mencucinya,
2. Merendam 200 gram kedelai tersebut ke dalam ± 500 mL air bersih selama 8 jam. Pada perendaman, kedelai akan mengembang; kedelai tersebut dicuci hingga kulitnya terkelupas,
3. Kedelai yang telah direndam dicuci berulang-ulang. Apabila kurang bersih maka tahu yang dihasilkan akan cepat menjadi asam;
4. Menumbuk kedelai tersebut dan menambahkan 200 mL air hangat per 100 gram kedelai, proses ini dilakukan sedikit demi sedikit hingga berbentuk bubur;
5. Bubur kedelai yang terbentuk ditambahkan dengan 400 mL air dan dipanaskan sampai mendidih. Pemanasan dilakukan sebanyak 3 kali sambil ditambahkan ± 100 mL setiap pendidihan. (ditandai dengan adanya gelembung-gelembung kecil);
6. Menyaring bubur kedelai dan mengendapkan airnya (dalam keadaan masih panas) dengan menggunakan batu tahu (Kalsium Sulfat = CaSO4) sebanyak 2 gram.
7. Mencetak endapan dengan kain pembungkus tahu

Penentuan Protein Dengan Metode Kjeldahl

1. Penimbangan sampel (kedelai mentah, susu kedelai, tahu) @ 1 gram dalam labu Kjeldahl;
2. Penambahkan Na2SO4 bebas air, Selenium, dan 10 mL H2SO4 pekat pada masing-masing sampel;
3. Pemanasan dilakukan hingga larutan menjadi bening;
4. Pengenceran larutan yang dihasilkan menjadi 25 mL dengan air bebas NH3;
5. Penambahan 10 mL larutan sampel tersebut ke dalam alat destilasi Kjeldahl dan menambahkan fenolftalein, NaOH 30%, proses dilakukan hingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda;
6. Ke dalam Erlenmeyer 100 mL, lakukan penambahan 10 mL larutan H3BO3 5%, serta beberapa tetes indikator BCG-MM;
7. NH3 yang keluar ditangkap dalam larutan H3BO3 5% yang telah diberi indikator MM dan BCG;
8. Proses destilasi larutan dilakukan sampai terjadi perubahan warna;
9. Menitrasi larutan dengan HCl 0.1 N.

Perhitungan kadar protein pada sampel :

% Nitrogen = _______100_______ x V. HCl x N HCl x 14,008
Massa sampel x 1000

% Protein = % Nitrogen x Faktor Nitrogen (5,71 untuk kacang kedelai)

Pembahasan

Proses Pembuatan Tahu

Proses pembuatan tahu pada percobaan ini dilakukan dengan menggunakan metode tradisional. Pada intinya proses pembuatan tahu secara tradisional, yaitu melalui proses penggumpalan susu kedelai. Proses penggumpalan ini akan menurunkan kelarutan dari partikel-partikel susu kedelai, sehingga membentuk agregat-agregat padat yang kita sebut dengan tahu.
Tahap pertama, yaitu perendaman biji kedelai dalam air selama delapan jam. Pada proses perendaman ini, biji kedelai akan mengembang dan melunakka dindingnya, dengan begitu memudahkan kita untuk memisahkan antara biji kedelai dengan kulitnya. Pengembangan biji kedelai ini disebabkan karena adanya penyerapan air oleh biji kedelai secara osmosis. Adanya gradient konsentrasi antara cairan dalam biji kedelai dengan air rendaman, membuat adanya tekanan osmotik yang mendorong air dengan konsentrasi yang tinggi menuju biji kedelai dengan kandungan air yang rendah. Seiring dengan masuknya air ke dalam biji kedelai, akan membuat biji kedelai lebih lunak dan mudah untuk dihancurkan pada tahap berikutnya.
Tahap kedua, yaitu proses pelumatan biji kedelai menjadi bubur kedelai. Proses pelumatan ini menggunakan blender dengan sejumlah air. Penambahan air ini, dimaksudkan agar biji kedelai menjadi lebih lunak dan mudah untuk dihancurkan. Selain itu, proses pelumatan biji kedelai ini dimaksudkan untuk mempermudah dihasilkannya sari kedelai yang akan digunakan pada pembuatan tahu.
Tahap ketiga ialah perebusan bubur kedelai dengan 200 mL air untuk setiap 100 gram biji kedelai sampel. Proses perebusan dilakukan sebanyak tiga kali. Untuk setiap perebusan, bubur kedelai dipanaskan hingga mendidih. Tujuan dari perebusan ini, yaitu untuk melarutkan protein yang terdapat pada bubur kedelai ke dalam air rebusan, yang berupa sari kedelai. Seperti yang diketahui, protein bersifat dapat larut dalam air. Dengan begitu air rebusan akan kaya dengan protein. Seiring dengan perebusan, air akan menguap setelah melewati titik didihnya. Menguapnya air akan meninggalkan protein dengan konsentrasi yang lebih pekat. Setelah proses pendidihan, maka air rebusan ditambahkan kembali dengan jumlah volume yang sama, yaitu 200 mL. Penambahan air rebusan ini bertujuan untuk menghilangkan pengembangan gelembung udara yang terbentuk dikarena pendidihan air. Dengan begitu tidak ada gelembung yang meninggalkan wadah, sehingga protein yang telah terlarut tidak ada yang meninggalkan sistem pemanasan. Penambahan air rebusan ini juga akan membuat semakin banyak protein yang akan larut dalam air. Semakin banyak jumlah penambahan air rebusan, maka akan membuat protein yang terlarut dalam sari kedelai semakin pekat komsentrasinya. Dari hasil perebusan ini, maka akan diperoleh susu kedelai. Susu kedelai yang dihasilkan inilah yang kemudian dijadikan sebagai bahan baku pembuatan tahu.
Tahap keempat, penarikan air yang terkandung dalam susu kedelai dengan menggunakan baku tahu (Kalsium Sulfat = CaSO4). Kalsium sulfat yang bersifat anhidrad ini akan menarik air yang terdapat dalam susu kedelai. Dengan penarikan air ini, akan membuat partikel dalam susu kedelai menurun kelarutannya dan menggumpal menjadi tahu. Semakin banyak kalsium sulfat yang ditambahkan dalam susu kedelai, maka akan semakin banyak partikel susu kedelai yang kehilangan kelarutannya. Dengan begitu tahu yang terbentuk akan semakin banyak.
Tahap terakhir dalam proses pembuatan tahu ini, yaitu pemadatan tahu. Gumpalan tahu yang terbentuk tersebut dicetak dan ditekan, tujuan perlakuan ini, yaitu agar gumpalan tahu yang terbentuk menjadi padat dan tidak mudah hancur.

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Kjeldahl

Prinsip dari penentuan kadar protein dengan metode kjedahl adalah penentuan jumlah Nitrogen (N) yang dikandung oleh suatu bahan dengan cara mendegradasi protein bahan organik dengan menggunakan asam sulfat pekat untuk menghasilkan nitrogen sebagai amonia, kemudian menghitung jumlah nitrogen yang terlepas sebagai amonia lalu mengkonversikan ke dalam kadar protein dengan mengalikannya dengan konstanta tertentu. Analisa protein dengan metode kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan, yaitu proses destruksi, proses destilasi, dan tahap titrasi.
Pada percobaan ini, akan dianalisis kadar protein pada kedelai mentah, kedelai rebus, susu kedelai, serta tahu.

1) Proses destruksi
Pada tahap ini, masing-masing sampel (kedelai mentah, kedelai rebus, susu kedelai, dan tahu) dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi penguraian sampel menjadi unsur-unsurnya yaitu unsur-unsur C, H, O, N, S, dan P. Unsur N dalam protein ini dipakai untuk menentukan kandungan protein dalam suatu bahan. Satu gram dari masing-masing sampel, yaitu kedelai mentah; kedelai rebus; susu kedelai; dan tahu ditambah dengan katalisator berupa campuran selenium sebanyak 0,5-1 gram. Sampel dan campuran selenium tersebut dimasukkan ke dalam labu kjedahl. Katalisator selenium ini berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dengan menaikkan titik didih asam sulfat saat dilakukan penambahan H2SO4 pekat, serta mempercepat kenaikan suhu asam sulfat, sehingga destruksi berjalan lebih cepat dan lebih sempurna. Katalisator N atau campuran selenium tersebut terdiri dari campuran Na2SO4 anhidrad dan CuSO4. Ion logam Cu akan menaikkan titik didih H2SO4 sedangkan Na2SO4 anhidrad akan menarik air yang terdapat pada sampel. Karena titik didih menjadi lebih tinggi, maka asam sulfat akan membutuhkan waktu yang lama untuk menguap. Karena hal ini, kontak asam sulfat dengan sampel akan lebih lama sehingga proses destruksi akan berjalan lebih efektif.
Setelah ditambah katalisator N, sampel dimasukkan dalam labu kjedahl kemudian ditambah dengan 10 ml H2SO4 pekat. H2SO4 pekat yang dipergunakan untuk destruksi diperhitungkan dari adanya bahan protein. Asam sulfat yang bersifat oksidator kuat akan mendestruksi sampel menjadi unsur-unsurnya. Untuk mendestruksi 1 gram protein diperlukan 9 gram asam sulfat. Penambahan asam sulfat dilakukan dalam ruang asam untuk menghindari S yang berada di dalam protein terurai menjadi SO2 yang sangat berbahaya. Setelah penambahan asam sulfat larutan menjadi keruh.
Labu kjedahl yang berisi sampel kemudian ditempatkan dalam alat destruksi (destruktor) dan ditutup dengan corong. Setelah siap alat dinyalakankan dan akan terjadi pemanasan yang mengakibatkan reaksi berjalan lebih cepat. Sampel didestruksi hingga larutan berwarna jernih yang mengindikasikan bahwa proses destruksi telah selesai. Selama destruksi, akan terjadi reaksi sebagai berikut,
2 Cu + H2SO4 --> Cu2SO4 + SO2 + 2 On
Cu2SO4 + 2 H2SO4 --> 2CuSO4 + 2 H2O + SO2
(CHON) + On + H2SO4 -->CO2 + H2O + (NH4)2SO4
Alat destruksi bekerja berdasar prinsip lemari asam. Selama proses destruksi akan dihasilkan gas SO2 yang berbau menyengat dan dapat membahayakan jika dihirup dalam jumlah relatif banyak. Gas yang dihasilkan ini akan bergerak ke atas (tersedot penutup) dan akan disalurkan ke alat penetral. Alat ini terdiri dari dua larutan yaitu NaOH dan aquadest. Awalnya gas SO2 akan masuk dalam tabung yang berisi NaOH. Dalam tabung ini terjadi penetralan gas SO2 oleh larutan NaOH. Kemudian gas hasil penetralan tahap pertama masuk dalam tabung kedua yang berisi aquadest. Dalam tabung ini kembali terjadi penetralan sehingga diharapkan semua gas SO2 telah ternetralkan.
Selain dibebaskan gas SO2 juga dibebaskan gas CO2 dan H2O sesuai dengan reaksi sebagai berikut: panas
Bahan organik + H2SO4 --> CO2 + SO2 + (NH4)2SO4 + H2O
Proses destruksi dapat dikatakan selesai apabila larutan berwarna jernih. Larutan yang jernih menunjukkan bahwa semua partikel padat bahan telah terdestruksi menjadi bentuk partikel yang larut tanpa ada partikel padat yang tersisa. Larutan jernih yang telah mengandung senyawa (NH4)2SO4 ini kemudian didinginkan supaya suhu sampel sama dengan suhu luar sehingga penambahan perlakuan lain pada proses berikutnya dapat memperoleh hasil yang diinginkan karena reaksi yang sebelumnya sudah usai.

2) Proses destilasi
Larutan sampel jernih yang telah dingin kemudian ditambah dengan aquadest untuk melarutkan sampel hasil destruksi agar hasil destruksi dapat didestilasi dengan sempurna serta untuk lebih memudahkan proses analisa karena hasil destruksi melekat pada labu kjedahl. Kemudian larutan sampel didestilasi dalam tabung destilasi. Pada dasarnya tujuan destilasi adalah memisahkan zat yang diinginkan, yaitu dengan memecah amonium sulfat menjadi amonia (NH3) dengan menambah beberapa mL NaOH hingga tepat basa, kemudian larutan sampel ini dipanaskan. Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam.
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan oleh pemanas dalam alat destilasi. Selain itu sifat NaOH yang apabila ditambah dengan aquadest menghasilkan panas, meski energinya tidak terlalu besar jika dibandingkan pemanasan dari alat destilasi, ikut memberikan masukan energi pada proses destilasi. Panas tinggi yang dihasilkan alat destilasi juga berasal dari reaksi antara NaOH dengan (NH4)2SO4 yang merupakan reaksi yang sangat eksoterm sehingga energinya sangat tinggi. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan asam standar. Asam standar yang dipakai dalam percobaan ini adalah asam borat. Asam standar yang dapat dipakai adalah asam borat 5 % sebanyak 10 mL.
Larutan sampel yang telah terdestruksi dimasukkan dalam tabung destilasi dan ditempatkan di sebelah kiri. Kemudian alat destilasi berupa pipa kecil panjang dimasukkan ke dalamnya hingga hampir mencapai dasar tabung reaksi sehingga diharapkan proses destilasi akan berjalan maksimal (sempurna). Erlenmeyer yang berisi 10 ml asam borat 5 % + BCG-MR (campuran brom cresol green dan methyl red) ditempatkan di bagian kanan bawah alat destilasi, seperti terlihat pada gambar hasil pengamatan. BCG-MR merupakan indikator yang bersifat amfoter, yaitu bisa bereaksi dengan asam maupun basa. Indikator ini digunakan untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Selain itu alasan pemilihan indikator ini adalah karena memiliki trayek pH 6-8 (melalui suasana asam dan basa / dapat bekerja pada suasana asam dan basa), yang berarti memiliki rentang trayek kerjanya yang luas (meliputi asam-netral-basa). Pada suasana asam, indikator akan berwarna merah muda, sedang pada suasana basa akan berwarna hijau-biru. Setelah ditambah BCG-MR, larutan akan berwarna merah muda karena berada dalam kondisi asam.
Asam borat (H3BO3) berfungsi sebagai penangkap NH3 sebagai destilat berupa gas yang bersifat basa. Supaya ammonia dapat ditangkap secara maksimal, maka sebaiknya ujung alat destilasi ini tercelup semua ke dalam larutan asam standar sehingga dapat ditentukan jumlah protein sesuai dengan kadar protein bahan. Selama proses destilasi lama-kelamaan larutan asam borat akan berubah warna menjadi hijau kebiruan, hal ini karena larutan menangkap adanya ammonia dalam bahan yang bersifat basa sehingga mengubah warna merah muda menjadi biru.
Reaksi yang terjadi :
(NH4)2SO4 + NaOH --> Na2SO4 + 2 NH4OH
2NH4OH --> 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 --> 2(NH4)2BO3 +H2
Reaksi destilasi akan berakhir bila ammonia yang telah terdestilasi tidak ada lagi, hal ini diuji dengan menggunakan kertas lakmus merah pada ujung alat destilasi. Apabila lakmus merah tidak berubah warna menjadi biru, maka proses destilasi telah selesai. Setelah destilasi selesai larutan sampel berwarna keruh dan larutan asam dalam erlenmeyer berwarna hijau kebiruan karena dalam suasana basa akibat menangkap ammonia. Ammonia yang terbentuk selama destilasi dapat ditangkap sebagai destilat setelah diembunkan (kondensasi) oleh pendingin balik di bagian belakang alat destilasi dan dialirkan ke dalam erlenmeyer.

3) Tahap titrasi
Titrasi merupakan tahap akhir dari seluruh metode Kjeldahl pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan yang dianalisis. Dengan melakukan titrasi, dapat diketahui banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia. Untuk tahap titrasi, destilat dititrasi dengan HCl yang telah distandarisasi (telah disiapkan) sebelumnya. Normalitas yang diperoleh dari hasil standarisasi adalah 0,1 N. Jadi, banyaknya HCl yang diperlukan untuk menetralkan ekuivalen dengan banyaknya N. Titrasi HCl dilakukan sampai titik ekuivalen yang ditandai dengan berubahnya warna larutan hijau kebiruan menjadi merah karena adanya HCl berlebih yang menyebabkan suasana asam (indikator BCG-MR berwarna merah muda pada suasana asam). Melalui titrasi ini, dapat diketahui kandungan N dalam bentuk NH4 sehingga kandungan N dalam protein pada sampel dapat diketahui.

Adanya penurunan kadar protein ini disebabkan adanya protein yang terdenaturasi selama proses pembuatan tahu. Proses perebusan telah meningkatkan suhu kacang kedelai yang digunakan. Suhu tinggi ini akan merusak ikatan hidrogen dari protein dan juga membuat molekul penyusun protein bergetar dikarenakan energi kinetiknya yang tinggi, hal ini akan mengacaukan ikatan yang ada antar molekul dan membuat protein terdenaturasi.
Hal yang sama juga terjadi ketika kedelai tersebut telah dihancurkan. Protein kedelai yang terdapat dalam kacang kedelai tidak sepenuhnya larut dalam air membentuk sari kedelai. Hal ini diduga membuat adanya protein yang tertinggal pada ampas kedelai. Hanya saja pada percobaan ini tidak dilakukan pengukuran kadar protein yang terdapat pada ampas kedelai. Karena dianggap protein kedelai larut sempurna dalam sari kedelai.
Sari kedelai ini dipanaskan kembali seiring dengan penambahan air. Proses pemanasan yang bertahap pada pembuatan tahu ini akan membuat protein yang berasal dari kedelai semakin banyak yang terdenaturasi karena panas. Oleh karena itu, sari kedelai yang terdapat dalam bentuk susu kedelai ini, semakin menurun kadar proteinnya.
Namun berbeda halnya dengan tahu, pada pembuatan tahu digunakan batu tahu yang berguna untuk menggumpalkan protein yang ada tanpa mendenaturasi protein yang terdapat di dalamnya. Penambahan batu tahu yang berupa garam K2SO4 ini akan menetralkan muatan yang ada dalam protein tersebut sehingga membuatnya terkoagulasi atau menggumpal.
Berdasarkan uji yang dilakukan, tahu memiliki kandungan protein yang lebih tinggi dibandingkan dengan susu kedelai serta kedelai rebus yang dihancurkan. Hal ini karena dengan adanya penggumpalan membuat protein yang ada dalam larutan memadat dan semakin terkonsentrasi proteinnya. Sehingga dalam satu gram susu kedelai yang mengandung sejumlah air akan memiliki konsentrasi protein yang lebih sedikit dibandingkan dengan satu gram protein pada tahu yang telah terhidrad (tidak mengandung air). Pada tahu 1 gram tersebut merupakan protein yang terkoagulasi dengan sedikit asupan air dalam beratnya. Dengan begitu kadar protein dalam tahu memiliki nilai yang lebih tinggi dibandingkan dengan susu kedelai.
Jika dibandingkan dengan kedelai rebus, tahu juga memiliki nilai kandungan protein yang lebih tinggi. Hal ini karena dalam bentuk kedelai rebusnya, protein yang ada masih terdapat dalam bentuk kedelai yang juga mengandung senyawa lain selain protein, seperti karbohidrat dan sebagainya. Oleh karena itu, dalam berat yang sama kedelai rebus akan memiliki persen berat protein yang lebih kecil dibandingkan dengan koagulasi protein dalam tahu.
Walaupun demikian, kadar protein tertinggi terdapat dalam kedelai mentah. Hal ini karena, walaupun dalam setiap biji kedelai tersebut terkandung senyawaan lain, namun protein yang terdapat di dalamnya belum mendapat perlakuan lain, seperti pemanasan, sehingga tidak adanya protein ang terdenaturasi.
Disamping analisis hasil yang telah dijabarkan di atas, maka terdapat beberapa faktor-faktor lain, seperti analisa faktor kesalahan selama percobaan. Faktor kesalahan tersebut, seperti adanya amonia yang keluar dari sistem selama proses destilasi, seperti melalui celah sepanjang saluran destilasi; ketika pengecekan tabung destilasi dengan kertas lakmus; tidak selalu tercelupnya tabung destilasi dalam asam borat; serta tidak rapatnya sistem pada labu erlemeyer.
Berdasarkan pemaparan di atas, terlihat bahwa kualitas tahu akan tergantung pada kadar protein yang terkandung didalamnya. Kadar protein tersebut akan dipengaruhi oleh perlakuan selama proses pembuatan, seperti pemanasan yang akan dapat mendenaturasi protein, pelumatan yang akan mengurangi jumlah protein yang dipakai karena terbuang dalam ampas, serta penggumpalan protein menjadi tahu.